Информация по проекту АР 23485115 «KASP-маркеры при создании и изучении тетраплоидной пшеницы с повышенным содержанием каротиноидов и улучшенным качеством клейковины»

Актуальность: Зерно твердой пшеницы является основным сырьем при производстве макаронных изделий, пасты, манной крупы, хлеба. Основными лимитирующими показателями качества зерна является глютен-индекс, содержание протеина и содержание желтого пигмента (каротиноидов), который известен как индекс желтизны (YI). Для успешного импорта казахстанской твердой пшеницы необходимо решить проблему количества и качества клейковины, увеличить содержание желтого пигмента в твердой пшенице. В этой связи, идея проекта комбинирование селекционных и современных биохимических, спектральных и молекулярно-генетических методов для создания высококачественных селекционных форм тетраплоидной пшеницы с улучшенными технологическими показателями и повышенным содержанием каротиноидов, на основе изучения генетического контроля клейковинных белков – глиадинов и глютенинов, каротиноидных пигментов с применением белковых и KASP-маркеров.

Цель проекта: Получить гибриды тетраплоидной пшеницы, изучить и провести отбор перспективных форм для создания селекционных линий с повышенным содержанием желтого пигментов (YPC - yellow pigment content) и улучшенным качеством клейковины в зерне на основе современных молекулярно-генетических и биохимических методов в условиях Северного Казахстана.

Ожидаемые результаты:

- за 2024 год: Будут созданы, проанализированы и отобраны гибриды тетраплоидной пшеницы с повышенным содержанием каротиноидов. будет проведен нативный и денатурирующий электрофорез глиадинов и глютенинов. По результатам исследований будет проведен отбор и возвратное насыщение (беккросс) перспективных селекционных форм с ценными качественными характеристиками. Будет проведена общая экстракция ДНК родительских и гибридных форм тетраплоидной пшеницы. Будут секвенированы по Сэнгеру фрагменты целевых генов Psy, Ppo и Glu-3 контролирующие синтез каротиноидов и низкомолекулярных субъединиц глютенина у контрастных и родительских форм для обнаружения SNP.

- за 2025 год: будут размножены гибридные формы тетраплоидной пшеницы с повышенным содержанием каротиноидов и качественной клейковиной, проведена биохимическая оценка по комплексу хозяйственно-ценных признаков. На основе выделенной ДНК родительских и гибридных форм проведено секвенирование фрагментов целевых генов Glu-3, Psy и Ppo, будут разработаны молекулярные SNP-маркеры низкомолекулярного глютенина и к генам контролирующим синтез каротиноидов, проведено генотипирование родительских и гибридных форм, проведена маркер-опосредованная селекция, отобраны и размножены наиболее перспективные селекционные линии с высоким содержанием каротиноидов и с улучшенными показателями хозяйственно-ценных и биохимических признаков.

- за 2026 год: Будут определены биохимические показатели качества (содержание протеина, клейковины, каротиноидов, золы и др и химическое строение фракций каротиноидов методом ЯМР-спектроскопии, установлен компонентный состав клейковинных белков на основе метода электрофореза глиадинов и глютенинов, аллельный состав генов Psy, Ppo и Glu-3 по полученным SNP-маркерам у константных форм пшеницы с повышенным содержанием каротиноидов и комплексом ценных биохимических и технологических характеристик. Публикация запланированных научных статей в рецензируемых журналах. Подача заявки на патент на полезную модель.

Достигнутые результаты:

За 2024 год: Проведена обработка почвы, посев проведен вручную по пару. Подготовлен посевной материал: семена 11 гибридов F2 тетраплоидной пшеницы полученные ранее по схеме Triticum durum Desf. × Triticum durum Desf., и высеяны на опытных делянках площадью по 2 м² на каждый образец. Проведен ручной посев пяти гибридов F1 созданных по схеме: Тауелсыздык 20 (Triticum aestivum L.) × Triticum turanicum Jakubz.; Дамсинская 90 (Triticum durum Desf) × Акмола 3 (Triticum aestivum L.); Дамсинская 90 (Triticum durum Desf) × Triticum persicum; Таймас (Triticum aestivum L.) × Triticum aethiopicum; Акмола 3 (Triticum aestivum L.) × Triticum persicum. Проведены наблюдения за морфологическим состоянием гибридов, учет вегетативной массы: в среднем кустистость составило 1,4 шт, высота растения 91,3 см, длина колоса 6,2 см; масса зерна с растения 1,72 г при разбросе от 1,32 г до 2,17 г. Урожайность составила в среднем 34,1 ц/га, максимальная урожайность 43,9 ц/га отмечена у линии Гордеиформе×Ne Odisseo, минимальная 26,7 ц/га у гибрида Ne Levante×Рая. Проанализированы родительские формы тетраплоидной пшеницы для подбора перспективных родительских форм для скрещивания. Биохимический анализ исходных форм показал: содержание протеина от 13,03 до 17,05%, содержание каротиноидов в среднем составило 0,292 мг/100 г, сумма аминокислот от 8,24 г/100 г в сорте Актобе 1 (Triticum durum Desf.) до 13,87 г/100 г Triticum aethiopicum; содержание клейковины до 43% при качестве 34 ед., объем седиментации до 40 мл. Зола в среднем 1,98%, при разбросе значений от 1,29 до 2,44%. Получены 9 межвидовых гибридов тетраплоидной пшеницы по схеме: Grekalle (Triticum durum Desf) × Triticum turanicum; Triticum persicum × Дамсинская 90 (Triticum durum Desf.); Triticum turanicum × Дурофинус (Triticum durum Desf); Тriticum dicoccum × Дамсинская 90 (Triticum durum Desf); Дамсинская 90 (Triticum durum Desf) × Triticum persicum; Дурофинус (Triticum durum Desf) × Дамсинская 90 (Triticum durum Desf); Тriticum dicoccum × Triticum turanicum; Triticum turanicum × Тriticum dicoccum; Дамсинская 90 (Triticum durum Desf) × Тriticum dicoccum. В полевых условиях 2024 года в питомнике гибридизации проведено 9 комбинаций скрещиваний, прокастрированно 850 цветков, завязалось 226 зерен, что составило 26.6 %.

Проанализированы гибриды тетраплоидной пшеницы с повышенным содержанием каротиноидов. Так содержание каротиноидов в среднем составило 0,360 мг/100 г, при максимальном значении 0,446 мг/100 г у гибрида Ne Odisseo×Гордеиформе; содержание протеина составило в среднем 14,4% и варьировало от 12,9% до 15,4%; содержание клейковины и ее качество в среднем 23,7% и 33 ед. соответственно. SDS-седиментация от 28 до 45 мл. При этом наивысшее значение натуры зерна 815 г/л составило у линии Levante×Актобе 1, а минимальное 768 г/л у линии Ne Odisseo×Гордеиформе, при среднем значении по всем линиям 787 г/л. Стекловидность зерна варьировало от 58 до 66% при среднем значении 63%. Методом электрофореза запасных белков установлено, что гибрид Levante × Актобе 1 по локусу Gli-B1 несет аллель Gli-B1а, который наследован от сорта Актобе 1. При этом в большей части гибридов присутствуют компоненты глиадина γ42 маркирующие качественную клейковину. Гибрид полученный в комбинации Рая × Levante гетерозиготен по глиадинкодирующим локусам, в частности встречаются аллели Gli-B1а и Gli-B1с. Так как в гибриде происходит расщепление то электрофоретический спектр состоит из компонентов присущие обоим родителям. В гибридах полученные по схеме Levante × Рая и Рая × Levante локус Gli-А2 характерен материнской форме. По глютенинкодирующим локусам чаще встречались аллели Glu-A1b и Glu-B1a. Проведен отбор перспективных селекционных форм для возвратного насыщения.

Проведена экстракция ДНК из родительских форм и гибридов в 3-4 кратной повторности. Получена коллекция ДНК состоящая из 129 образцов, определена концентрация которая составила от 103 нг/мкл до 6304,2 нг/мкл. Для уточнения и определения достоверности экстракции ДНК проведен электрофорез ДНК в 1,5% агарозном геле, с добавлением бромистого этидия

Секвенированы фрагменты генов Psy, Ppoи Glu-3 контролирующих синтез каротиноидов и низкомолекулярного глютенина. Так проведен анализ родительских форм и потомств гибридных популяций по группе генов семейства Psy (фитоенсинтетаза), Ppo (полифенолоксидаза) и Glu-3 (низкомолекулярный глютенин). Разработаны праймеры Psy-1-22-F, Psy-1-22-R (размер амликона – 537 п.н.) и Glu-3-34-F, Glu-3-34-R (размер амликона – 715 п.н.). Проведено секвенирование по Сэнгеру продуктов ПЦР по трем отобранным генам Psy-1, Ppo и Glu-3 у родительских форм твердой пшеницы гибридов: Рая×Таймас и Levante × Condure. При этом, между родительскими формами Рая и Таймас были выделены различия по другому SNP (597 п.н.). На основе секвенирования сделан сравнительный анализ полученной нуклеотидной последовательности изучаемых фрагментов генов с известными опубликованными последовательностями с помощью биоинформатической программы Clustal-W. В результате, удалось провести анализ по наиболее перспективным генетическим районам, которые сцеплены с потенциальными генами-кандидатами, контролирующие высокое содержание каротиноидов и биохимические показатели качества. При сравнении сиквенсов четырех родительских форм твердой пшеницы были обнаружены SNP. По гену Glu-3 у всех проверенных генотипов распределение аллелей SNP [G] и [A] было достаточно равномерным. Однако, между родительскими формами Рая и Таймас были выделены различия по другому SNP. При изучении результатов секвенирования гибрида Levante × Condure обнаружены SNP (104 п.н.) по гену Psy-1, который соответствовал аллелям [G] и [Т]. Написание годового отчета.

За 2025 год: Проведен биохимический анализ гибридных форм по содержанию каротиноидов от 0,302 до 0,446 мг/100 г в среднем 0,360 мг/100 г, протеина составило в среднем 14,4%. Качество клейковины составило в среднем 33 ед. ИДК при содержании в 24%. Проведен аминокислотный анализ гибридных популяций на приборе Капель 105 М, определена сбалансированность содержания заменимых и незаменимых аминокислот, жирнокислотный анализ гибридных популяций по определению содержания ненасыщенных жирных кислот показал присутствие линолевой, пальмитиновой, олеиновой кислот в среднем от 0,10 до 0,25 г/100 г.

Выделены образцы ДНК из растений, выращенных в теплице и фитотроне, включая родителей и селекционные линии, полученные из гибридных потомств. Создана коллекция ДНК гибридов тетраплоидной пшеницы с известным биохимическим составом (содержание каротиноидов, количество и качество клейковины) в количестве 20 образцов: 21/04/1, 188-05-4, 69-08-2, 333-05-5, 203-00-2, 69-08-3, 69-08-14, 148-11-11, 272-08-9, 88-10-14, 272-08-14, 156-11-9, 156-11-10, 149-12-15, 88-12-6, 93-13-3, 124-11-15, 128-11-1, 128-11-20, 356-11-24.

Проведено секвенирование по Сэнгеру фрагмента целевых генов Psy, Ppo и Glu-3 у родительских форм для обнаружения SNP. Были выделены и очищены ПЦР продукты амплифицированных фрагментов в кодирующей зоне гомологичных генов семейства Psy (TdPsy1-A1I, TdPsy1-A1a и TdPsy1-A1o). В результате, с помощью программы CLUSTAL-анализа и сравнения с референтным геном сорта тетраплоидной пшеницы Svevo, обнаружены специфические полиморфные фрагменты. При секвенировании и сравнительном анализе фрагмента генов Psy1A1 и GluB1a1 выделили 3 SNP у 26 форм твердой пшеницы, включая Sycysco, Raya, Aktobe1, Taimas, Tauseldyk20 и другие, указывающие на полиморфизм в интронах генов между изученными генотипами.

Проведен ручной посев гибридов первого поколения тетраплоидной пшеницы в питомнике размножения: 201/24 (Tr persicum × Дамсинская 90), 204/24 (Дамсинская 90 × Tr. persicum), 3/22 (Tr. turanicum × Шортандинская 2007), 203/24 (Tr. dicoccum × Дамсинская 90), 1/25 (Дамсинская 2017 × Grecalle), 2/25 (Grecalle × Red River 65). Посеяны гибриды для определения характера наследования: Grecalle (♀) - гибрид 200/24 – Tr. turanicum (♂); Tr. turanicum (♀) – гибрид 202/24 – Дурофинус (♂); Дурофинус (♀) – гибрид 205/24 – Дамсинская 90 (♂); Tr. turanicum (♀) – гибрид 207/24 – Tr. dicoccum (♂). Заложены питомники размножения коллекции иностранных сортов тетраплоидной пшеницы: Langdon, LD 134, Khapli, LD 12, Yan-Yang 5, Portugal 37, Amjad, IG-130979, Cyprus 4, Condure, Anhinga S, Buck Candusur и 2 образца гексаплоидной пшеницы: Chinese Spring, Neepawa. Разработаны модифицированные молекулярные маркеры KASP на основе выделенных SNP в целевых генах Psy, Ppo и Glu-3. Данные маркеры основаны на дизайне и применении специфических праймерах для гена Psy: PsyB1-mKASP-F1, PsyB1-mKASP-F2, а для гена Glu-3: Glu3-mKASP-F1. К аллель-специфическим праймерам были прикреплены фрагменты, соответствующие флуорофорам FAM и HEX, таким образом, чтобы они отвечали требованиям анализа KASP. Работа продолжается.

Члены исследовательской группы: